Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Регенеративная медицина достигла значительных успехов и постепенно становится реальной альтернативой трансплантологии. Уже возможно восстановление фрагментов хряща и костей, а также, хотя и в меньшей степени, мягких тканей и целых органов путём имплантации в область повреждения клеток или тканеинженерных конструкций, сочетающих в себе клетки и скаффолды. Однако, существующие методы диагностики (рентген, УЗИ, МРТ, КТ) не позволяют чётко различать имплантаты на фоне окружающих тканей в силу сходства их физических характеристик. Поэтому, без взятия биопсии невозможно своевременно выявить потенциальные осложнения операции, главными из которых являются миграция имплантата, недостаточный или избыточный рост регенерирующей ткани, стремительный лизис имплантата и возникновение рубцов на месте имплантации. Кроме того, нет методов управления ходом регенерации (скоростью и объёмом растущей ткани, направленностью роста и т.п.) и связанных с ней реакций (лизисом скаффолдов, воспалением и рубцеванием). В проекте ведутся разработки уникальных материалов, методов и устройств, которые позволят впервые решить две важнейшие задачи регенеративной медицины: 1) обеспечение неинвазивной (безбиопсийной) послеоперационной диагностики состояния тканеинженерных имплантатов и окружающих тканей и 2) осуществление внешнего управления ходом регенерации и ассоциированных с ней реакций. Кроме того, можно ожидать, что многие разработки, сделанные в ходе проекта, будучи патентоспособными, также будут способствовать приоритету РФ в областях науки, образования и производства, в т.ч. не связанных непосредственно с регенеративной медициной. За первый год выполнения проекта были получены следующие наиболее значимые научные результаты: 1) Разработана методика модификации гиалуроновой кислоты (ГК) путем конъюгации ГК с глицидилметакрилатом (ГМА). Продемонстрировано, что степень замещения ГМА в молекуле ГК может регулироваться путем изменения рН реакционной среды. Максимальная степень замещения (до 40%) достигается при реакции ГК с ГМА в нейтральной среде путем замены триэтиламина на тетраэтиламмоний бромид. 2) Разработаны методики фотополимеризации водных растворов гиалуроновой кислоты (ГК) с метакрилатными звеньями с использованием флавинмононуклеатида (FMN) в качестве фотоинициатора. Определен пороговый уровень концентрации метакрилированной гиалуроновой кислоты (МГК) способных к сшиванию макромолекул необходимых для изменения механических свойств гидрогеля. 3) Разработан протокол синтеза антистоксовых нанофосфоров и резофоров, предназначенных для контрастирования смарт-скаффолдов и реализации интерактивных взаимодействий с имплантатами на основе смарт-скаффолдов. 4) Созданы и опробованы специализированные системы получения оптических изображений, способной регистрировать слабые сигналы от апконвертирующих и резофорных наночастиц включенных в материал скаффолд структуры, сохраняя параметры возбуждения сигнала люминесценции в пределах допустимых лазерных доз. 5) Разработаны специализированные системы – 3D принтер, для печати матриксов (скаффолдов) на основе гиалуроновой кислоты, методом синхронной экструзии и экспонирования УФ излучением фотополимеризуемого гидрогеля (ФПК) на основе МГК. Нами предложен и реализован новый способ фотоотверждения композиций биосовместимых гидрогелей заключающийся в том, что активация процесса полимеризации происходит при экструдировании гидрогеля в водную среду содержащую предварительно наработанные радикалы, способные инициировать реакцию сшивания гидрогеля. Такой подход дает возможность формирования полых трубчаты структур из гидрогеля МГК и полностью совместим с технологией 3D печати. 6) Проведены пилотные эксперименты по in vitro оценке цитотоксичности скаффолдов и их имплантации в малых животных.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В данном проекте стоит задача получения конструкций для регенеративной медицины на основе гиалуроновой кислоты, которая является биосовместимым и биодеградируемым полимером. Одним из способов создания гидрогелевых конструкций, которые отвечают требованиям использования их в качестве скаффолдов для решения задач регенеративной медицины, является отверждение растворов полимеров посредством сшивки в ходе фотоиндуцируемых радикальных реакций. Для проведения радикальных реакций отверждения проводят модификацию гиалуроновой кислоты путем введения звеньев с двойными связями в процессе полимераналогичных превращений. Оптимизация количественного метода определения двойных связей в модифицированной ГК при участии KMnO4 позволила быстро оценить влияние различных параметров полимеризации, таких как концентрация инициатора, активатора, сшивающего агента и др., на процесс расходования групп с двойными связями во времени, т.е. следить за относительным изменением конверсии от времени. Подтверждена биорезорбируемость гидрогеля на основе МГК. Проведено формирование трехмерных биосовместимых структур заданной архитектоники на основе гиалуроновой кислоты в соответствие с их компьютерными 3D моделями из гидрогеля гиалуроновой кислоты, модифицированной глицидилметакрилатом, (МГК) методом экструзионной печати, совмещенной с синхронным экспонированием сфокусированным лазерным излучением фотосшиваемого гидрогеля. Рибофлавин мононуклеотид использован в качестве фотосенсибилизатора, способного под воздействием излучения в ультрафиолетовой / синей области спектра к генерации активных форм кислорода. Экспериментально определенная минимальная концентрация МГК в гидрогеле, при которой возможно образование единой пронизывающей весь объем жесткой трёхмерной сетки составила 16 масс.%. При указанной концентрации и выше создаваемая фотоотверждаемая композиция (ФОК) имеет высокую вязкость для традиционной гидрогелевой 3D печати. Поэтому для равномерного нанесения гидрогелевых слоев был специально разработан и изготовлен оригинальный трехмерный экструзионный принтер, обладающий повышенной мощностью экструдера и точностью позиционирования. Впервые был опробован процесс экструзии способной к фотоотверждению ФОК на основе МГК в водный раствор рибофлавина мононуклеотида, возбуждаемый лазером на длине волны 450 нм, при этом живые клетки иммортализованных человеческих кератиноцитов HaCaT находились ФОК. Исследования острой цитотоксичности образцов MTT методом показали, что гидрогелевые экстракты незначительно замедлили рост клеток BJ-5ta (на 10–20% в сравнении с контролем). Фибробласты способны прикрепляться и расти на поверхности гидрогеля, подтверждая высокую биосовместимость образцов. Проведены in-vitro тесты с использованием первичных клеток гиппокампа. Выживаемость первичных культур гиппокампа оценивалась на 14 день in vitro путем подсчета с помощью инвертирующего флюоресцентного микроскопа Leica DMIL HC (Leica, Германия) числа клеточных ядер окрашенных пропидием йодидом (мертвые клетки) и числа клеточных ядер окрашенных бис-бензимидом (Sigma, США) (все клетки культуры). Соотношение мертвых клеток высчитывалось в процентном соотношении между бис-бензимид-позитивными клетками и пропидий йодид-положительными клетками. Тест на клеточную выживаемость не показал значительных изменений в количестве мертвых клеток по сравнению с контрольной группой. Доля живых клеток в контроле 1 составляла 97±2,3%, в контроле 2 - 94±3,5%, в экспериментальной группе - 95±1.9%. Поэтому можно заключить, что гидрогели на основе МГК не токсичны для клеток нервной сстемы. На 14 день исследования культуры наблюдалась спонтанная кальциевая активность в контрольных культурах (Контоль 1). Процент клеток, демонстрирующих кальциевую активность составлял до 74,4±15,8%; продолжительность кальциевых осцилляций было 8,8±0,1 с, а частота кальциевых осцилляций в минуту 1±0,07. Такой уровень кальциевой активности характерен для этого периода развития первичных клеток гиппокампа средней плотности. Диссоциированные культуры гиппокампакультивированные на скаффолдах тоже продемонстрировали кальциевую активность. Однако, количество клеток с кальциевой активностью (25,2±11,6%) было значительно ниже, чем в " Контроле 1". Изменения в колебательном профиле проявляются в пятикратном снижении частоты кальциевых событий (0.2 ± 0.01 осцилляций/мин) и в увеличении длительности кальциевых осцилляций (12,6±1,2 с). Снижение частоты кальциевых событий на фоне увеличения продолжительности колебаний кальция свидетельствует о преобладающей роли глиальных элементов (астроцитов) в реализации функциональной метаболической активности культуры. Методом электроспиннинга созданы волокнистые скаффолды из коллагена. Для приготовления композиций использовали коммерчески доступный 2%-ый препарат коллагена производства ООО «Белкозин» в уксусной кислоте. Очистку коллагена от низкомолекулярных фракций и удаление уксусной кислоты проводили с помощью диализа в диализных мешках. Определены сшиватели и методика, которые могут быть использованы для закрепления получаемых структур. Для демонстрации люминесцентного отклика формируемых матриксов на основе коллагена и МГК были создана специальные имиджинговые системы. Для выполнения сложных задач визуализации биологических объектов создана система детектирования, построенная на принципе отложенной регистрации сигнала люминесценции. Временная задержка в такой системе достигается за счет синхронизации временных окон импульса возбуждения и сигнала люминесценции. Задержка детектируемого сигнала позволяет затухнуть фоновой автолюминесценции с коротким (наносекундным) временем жизни до того, как будет получен сигнал от метки с большим временим жизни, превышающим времена автофлуоресценции живых систем. Временная селекция способна обеспечить полное разделение изображения единичных молекулярных меток от сигналов помех. Для построения системы отложенной регистрации мы синтезировали наночастицы β-NaYF4: 20%Yb3+; 0,6%Tm3+/ NaYF4 и выполнили исследование временной динамики антистоксовой люминесценции при импульсном ИК возбуждении (длительность импульса от 50 мкс - 2000 мкс). Синтезированные нами апконвертирующие наночастицы типа NaYF4 хорошо подходят для получения люминесцентного сигнала, регистрируемого созданными эпилюминесцентным микроскопом и широкопольной системой. Возбуждение и люминесценция в ближней ИК области спектра апконвертирующих наночастиц позволяет рассматривать их в качестве люминесцентных маркеров для глубокого оптического зондирования биотканей. Значительная временная задержка между возбуждающим лазерным импульсом и развитием сигнала фотолюминесценции в апконвертирующих наночастицах позволяет реализовать бесфоновую оптическую визуализацию с временной задержкой. Показана возможность использования этого класса наночастиц для детектирования сигнала фотолюминесценции во втором окне прозрачности биоткани. Высокая квантовая эффективность кристаллов легированных ионами Yb3+, большое сечение поглощения и длительное время жизни возбужденного состояния открывает возможность визуализации с отложенной регистрацией, построенной на резонансном возбуждении и детектировании сигнала фотолюминесценции ионов Yb3+, расширяя возможности биоимиджинга для выполнения сложных задач визуализации биологических объектов.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Современная биофотоника широко использует аддитивные технологии для создания трехмерных структур для биомедицинских применений. Несмотря на существование большого количества различных методов, основанных на фотополимеризации, выполнение процесса фотоотверждения в глубине рассеивающей среды остается сложной задачей из-за небольшой глубины проникновения ультрафиолетового света, необходимого для возбуждения молекул фотоинициатора. Чтобы решить эту проблему, был предложен уникальный супрамолекулярный комплекс, содержащий фотоинициатор в комбинации с апконвертирующими наночастицами β-NaYF4: Yb3+, Tm3+ / NaYF4. При облучении светом на длине волны 975 нм возможно реализовать резонансный перенос энергии от наночастицы на фотоинициатор, который запускает реакцию радикальной сшивки модифицированной гиалуроновой кислоты. В этом случае активация процесса фотополимеризации может быть инициирована под действием света ближнего ИК-диапазона, попадающего в окно прозрачности биоткани. В рамках проекта были синтезированы апконвертирующие наночастицы β-NaYF4: Yb3+, Tm3+ / NaYF4, обладающие линиями фотолюминесценции на длинах волн 345 и 360 нм при возбуждении на длине волны 975 нм и коэффициентом конверсии 10%. Проведена модификация их поверхности, благодаря чему удалось гидрофилизировать апконвертирующие наночастицы и конъюгировать их с фотоинициатором Irgacure 369. Для демонстрации процесса фотосшивания были созданы нетоксичные композиции на основе модифицированной гиалуроновой кислоты. Модификацию гиалуроновой кислоты проводили по оригинальной методике, позволяющей синтезировать 10 г модифицированной гиалуроновой кислоты за 1 сутки с контролируемой степенью замещения от 10 до 70 %. В ходе проекта продемонстрирован процесс формирования трехмерной структуры in situ в объеме композиции на основе модифицированной гиалуроновой кислоты под фантомом. Эта методика может применяться не только для формирования трехмерных полимерных структур, но и для решения задачи контролируемого изменения степени сшивки гидрогелей. С использованием эндогенного фотоинициатора флавинмононуклеотида синтезированы композиции на основе модифицированной гиалуроновой кислоты, способные к фотосшиванию под действием синего света на длине волны 445 нм. Данные композиции были использованы для создания 3D гидрогелевых матриксов с помощью экструзионного принтера. Разработана методика сшивания нетканых коллагеновых пленок, созданных методом электроспиннинга, позволяющий не терять волокнистую структуру пленки после помещения в водные растворы. Методика основана на реакции сшивки коллагеновой структуры с помощью диглицидилового эфира 1,4-бутандиола в изопропаноле. Разработана методика формирования гибридных скаффолд-структур на основе матриксов коллагена I типа, формируемых методом электроспиннинга и фотоотвержденных структур на основе модифицированной гиалуроновой кислоты, напечатанных на 3D экструзионном принтере. Для этого методом электроспиннинга на осадительном электроде формировалась коллагеновая пленка, затем на пленку наносился матрикс, напечатанный с помощью экструзионной 3D печати, который сверху также покрывали коллагеновой пленкой. Таким образом, матрикс на основе модифицированной гиалуроновой кислоты располагался между двумя коллагеновыми пленками, формируя структуру по типу «ядро-оболочка». Для создания гибридных слоистых структур на скаффолды со структурой «ядро-оболочка» наносился последующий слой, напечатанный на 3D экструзионном принтере, который покрывался коллагеновой пленкой на следующем шаге техпроцесса. Изучение взаимодействия скаффолдов и клеток in vitro было выполнено с использованием линейных культур человеческих фибробластов Bj-5ta и линии клеток эпителия пуповинной вены человека HUVEC. Способность клеток прикрепляться и пролиферировать на поверхности скаффолдов была оценена методом МТТ-теста и методом флуоресцентной конфокальной микроскопии. Показано, что фибробласты Bj-5ta способны в течение нескольких дней прикрепляться к поверхности скаффолдов, причем как скаффолдов с чередующимися слоями, так и со структурой «ядро-оболочка». Клетки прикрепляются к краям скаффолдов. Уже после 6-9 дней инкубирования такие клетки образуют плотный слой, что подтверждает привлекательность данного типа поверхности для роста и пролиферации клеток, а также свидетельствует об отсутствии токсичности скаффолдов. Для количественной оценки роста клеток на поверхности скаффолдов, а также для исследования динамики колонизации матриксов, был проведен МТТ-тест. Показано, что фибробласты Bj-5ta имели более активный рост на скаффолдах со структурой «ядро-оболочка», чем на скаффолдах со слоистой структурой, что наблюдалось на протяжении всего срока культивирования (до 9 дней). При этом наиболее активный рост клеток наблюдался в интервале с 3 по 6 день, что может быть связано с колонизацией поверхности скаффолда клетками. В интервале с 6 по 9 день количество клеток изменялось незначительно, поскольку к этому моменту клетки уже заняли всю доступную для роста поверхность. Динамика колонизации скаффолдов была визуализирована с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Показано, что клетки распределялись по скаффолду, и это распределение соответствует трехмерной структуре самого скаффолда. При этом на 6-9 день культивирования фибробласты Bj-5ta формировали агрегаты, свидетельствующие о росте и пролиферации клеток. Клетки эпителия пуповинной вены человека HUVEC также способны прикрепляться к поверхности скаффолда, однако сравнение динамики роста фибробластов Bj-5ta и эпителиальных клеток HUVEC затруднено разницей в скорости их роста. Проведена оценка динамики роста клеток в скаффолдах на основе децеллюризированных тканей. Скаффолды на основе децеллюризированных тканей являются альтернативой синтетическим скаффолдам. Такие скаффолды трудно стандартизовать и модифицировать под те или иные задачи биомедицинской инженерии, поскольку их получение связано с использованием первичного биологического материала. С другой стороны, скаффолды на основе децеллюризированных тканей сохраняют многие особенности тканей in vivo, в том числе структуру, наличие белков внеклеточного матрикса и т.д. Ввиду этих особенностей, такие скаффолды интересны для изучения биологических аспектов расселения клеток по объему скаффолда и моделирования различных процессов, в том числе ангиогенеза и метастазирования. В данном Проекте мы исследовали один из вариантов скаффолда на основе децеллюризированных тканей - тканеинженерные конструкции на основе децеллюризированных тканей куриных эмбрионов. Для этого печень куриных эмбрионов (18 день развития) промывали в стерильном фосфатном буфере и децеллюризировали с помощью 0,1% раствора додецилсульфата натрия в физиологическом растворе на платформе орбитального шейкера в течение суток, после чего промывали децеллюризирвоанную ткань до достижения бесцветности и прозрачности. Полученные ткани хранили в стерильных условиях. Было обнаружено, что такой подход позволяет хорошо сохранять белки внеклеточного матрикса печени. Тканеинженерные конструкции были получены путем засева скаффолдов клетками рака молочной железы MDA-MB-231. Клетки росли на поверхности и в объеме скафолдов в статичной культуре in vitro в течение 4 недель. Сравнительный анализ роста клеток в 2D и 3D культурах in vitro был проведен с использованием МТТ теста. Было обнаружено, что количество жизнеспособных клеток, прикрепившихся к поверхности тканеинженерных конструкций в первый день, составляет ~ 15% от популяции живых клеток в соответствующей 2D культуре. Клетки в 2D культурах и в тканеинженерных конструкциях демонстрировали различные характеристики роста. Различия между количеством жизнеспособных клеток в культурах 2D и тканеинженерных конструкциях были статистически значимыми в каждый момент времени. В течение 1-й недели рост, наблюдаемый в культурах 2D, был намного быстрее, чем в тканеинженерных конструкциях. В последующие 2 недели количество клеток прирастало в 2D культурах и 3D тканеинженерных конструкциях схожим образом из-за резкого замедления скорости роста в монослое и медленной, но устойчивой пролиферации клеток в тканеинженерных конструкциях. В ходе заключительной 4-й недели темпы роста в обоих типах культур снизились по сравнению с 3-й неделей. Подобный паттерн роста схож с тем, который мы наблюдали для синтетических скаффолдов, заселенных фибробластами: быстрый рост на начальных сроках после добавления клеток и замедленный - в конце, после заселения клетками доступного объема. Жесткость скаффолда - один из важных параметров, который влияет на успешность дальнейшего заселения скаффолда клетками - как in vitro, так и in vivo. В данном Проекте мы оценили изменения уровней экспрессии биомаркеров, ассоциированных с эпителиально-мезенхимальным переходом, в зависимости от жесткости скаффолда. Для этого мы использовали клетки трижды негативного рака молочной железы человека в качестве клеточной модели с высокой пластичностью. Клетки трижды негативного рака молочной железы культивировали на субстратах с пятью физиологически релевантными модулями упругости, варьирующимися от 0,2 кПа до 64 кПа. Выбор значений жесткости определялся профилями жесткости органов и тканей in vivo. Для количественной оценки влияния жесткости на морфологию клетки мы использовали метод высокопроизводительного скрининга на основе анализа изображений с применением статистического анализа. Биосовместимые силиконовые субстраты были предварительно покрыты коллагеном I типа и помещены на дно лунок. Клетки трижды негативного рака молочной железы культивировали в течение 24 часов с последующей фиксацией и окрашиванием антителами. Соотношение ядро: цитоплазма, обычно используемое в гистопатологии в качестве предиктора злокачественности, показало самую высокую корреляцию с жесткостью скаффолда. Локальный максимум этого соотношения был обнаружен при 2 кПа, в то время как наименьшие значения наблюдались при 32 кПа и 64 кПа. Мы также оценили роль жесткости матрикса в экспрессии ключевых биомаркеров эпителиально-мезенхимального перехода. Показаны изменения в уровнях экспрессии е-кадгерина, цитокератинов и виментина в зависимости от значений жесткости субстрата. Так, для е-кадгерина можно заметить локальный минимум при 2 кПа с последующим повышением при 64 кПа. Это указывает на то, что клетки трижды негативного рака молочной железы очень чувствительны даже к небольшим изменениям жесткости субстрата. Низкие значения е-кадгерина и увеличение виментина при 2 кПа позволяют предположить развитие эпителиально-мезенхимального перехода в клетках трижды негативного рака молочной железы, культивируемых на скаффолдах с низкой жесткостью. В целом, мы показали, что более мягкие скаффолды способствуют сдвигу морфологичских характеристик клетки в сторону мезенхимального фенотипа в клетках трижды негативного рака молочной железы, в то время как жесткие субстраты приводят к более эпителиальному фенотипу. При этом пониженная жёсткость скаффолда способствует формированию более агрессивного фенотипа в клетках трижды негативного рака молочной железы, что наиболее выражено при жесткости 2 кПа. Это важно, так как высокая приспособляемость к изменяющимся условиям микроокружения является отличительной чертой метастатического рака. Однако изменение профиля экспрессии белков внеклеточного матрикса в ответ на изменение жесткости субстрата может быть важным параметром и для тканевой инженерии, так как может способствовать направленной дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток и влиять на ангиогенез и процессы биоразложения скаффолда. Для in vivo экспериментов скаффолд со структурой «ядро-оболочка» и внедренными апконвертирующими наночастицами помещался подкожно на дорсальную область мыши. На 17 день скаффолд с прилегающей тканью брали на гистологию. Имплантированные композитные скаффолды, состоящие из метакрилированной гиалуроновой кислоты и коллагеновых пластин с апконвертирующими наночастицами, вызывают резко выраженную воспалительную реакцию с явлениями интенсивной пролиферации клеток (предположительно, в основном, макрофагов и лимфоцитов) и интерстициальным отеком. Зона экссудативно-пролиферативного воспаления морфологически определяется расстоянием не менее 800 мкм – 1 мм от наружных поверхностей коллагеновых пластин. Внутренняя область скаффолдов (метакрилированная гиалуроновая кислота) разрушается раньше, чем коллагеновые пластины, располагающиеся на поверхности и содержащие апконвертирующие наночастицы. Наружные поверхности коллагеновых пластин умеренно плотно инфильтрируются воспалительными клетками на десятки микрон в глубину. Более глубоко расположенные участки пластин характеризуются диффузной воспалительной клеточной инфильтрацией, а также разрыхлением структуры, что указывает на высокую вероятность активной макрофагальной резорбции, как фагоцитарной, так и энзиматической природы.